Принимал активное участие в деятельности Абрамцевского кружка: в 1879 оформил спектакль «Два мира» А. Н. Майкова, написал музыку к спектаклю и сам стал исполнителем главной роли. В 1880 принимал участие в проектировании и разработке оформления интерьера церкви в Абрамцеве.

В 1881–1882 предпринял первое путешествие на Восток: в Египет, Сирию, Палестину, а также в Грецию в связи с работой над картиной «Христос и грешница».

В 1882–1895 преподавал в Московском училище живописи, ваяния и зодчества. В 1883 оформил спектакль «Алая роза» С. Мамонтова.

В 1883–1884 работал в Риме над эскизами и этюдами для картины «Христос и грешница». В 1885 экспонировал на XIII выставке Товарищества передвижных художественных выставок (ТПХВ) коллекцию этюдов 1881–1882, привезенных из путешествия на Восток.

В 1885 оформил в Большом театре оперу «Уриэль Акоста» В. С. Серовой, оперы «Фауст» Ш. Гуно и «Фальстаф» Д. Верди в Русской частной опере С. Мамонтова в Москве. В 1887 на XV выставке ТПХВ экспонировал картину «Христос и грешница».

В 1890–1892 приобрел имение Бехово на Оке и построил по собственному проекту усадебный дом, в котором разместились музей, включающий собрание предметов декоративно-прикладного искусства, археологическую коллекцию, и картинная галерея с работами мастера, его друзей и учеников, открытые для публики. В 1893–1900-х участвовал в выставках Московского Товарищества художников, экспонируя свои пейзажи. В 1894 исполнил декорацию к живой картине «Афродита», поставленной на первом съезде художников. В 1895 в Риме работал над картиной «Среди учителей». В 1897–1898 выполнил эскизы декораций к опере «Орфей и Эвридика» К. Глюка в Русской частной опере. В 1899 совершил второе путешествие на Восток, во время которого писал этюды к циклу картин «Из жизни Христа».

В 1890 — 1900-е работал над картинами цикла «Из жизни Христа». В этот период им были созданы духовные музыкальные сочинения «Всенощная» и «Литургия». В 1902 разработал программу стенных росписей для музея изящных искусств в Москве. В 1903 исполнил проект церкви в селе Бехово (построена в 1906). В 1904 в Борке по собственному проекту построил мастерскую «Аббатство». В 1906 в Большом зале московской Консерватории силами музыкантов-любителей была исполнена опера «Призраки Эллады», написанная Поленовым на либретто С. И. Мамонтова.

В 1907 совершил путешествие по городам Германии и Италии. В 1909–1910 в Петербурге, Москве и других городах России, а также в Праге состоялись выставки картин цикла «Из жизни Христа». В 1910–1911 совершил путешествие по городам Германии, Франции, Испании, Греции. На средства Поленова была построена школа в селе Страхово, расположенном рядом с Беховым. В 1914 в Москве состоялась выставка картин цикла «Из жизни Христа», сбор от которой был определен в пользу раненых Первой мировой войны.

В 1915 по проекту Поленова в Москве был построен дом для «Секции содействия фабричным и деревенским театрам» (с 1921 — Дом театрального просвещения им. академика В. Д. Поленова). В 1920–1921 для светового театра-диорамы в Борке исполнил 65 небольших картин, представляющих кругосветное путешествие. В 1924 состоялась первая персональная выставка работ мастера в Государственной Третьяковской галерее. В 1926 Поленову было присвоено звание народного художника.

В. Д. Поленов в основном известен как мастер композиций на библейские сюжеты и художник-пейзажист. Обращаясь к евангельским сюжетам, он стремился переосмыслить их традиционное, академическое изложение, заострить нравственную проблематику — в том числе и путем изменения пейзажной или жанровой окраски своих произведений. Продолжал традиции лирического пейзажа А. К. Саврасова и Ф. А. Васильева, привнеся в картину живую непосредственность этюда. Большое внимание, которое он уделял проблемам плэнера, его понимание этюда как самостоятельного художественного произведения оказали значительное влияние на творчество живописцев следующего поколения.

Работы Поленова в настоящее время имеются в собраниях таких музеев, как Государственная Третьяковская галерея, Государственный Русский музей, Государственный музей-заповедник В. Д. Поленова, Государственный музей-заповедник «Абрамцево», Государственный центральный театральный музей им. А. А. Бахрушина, Нижегородский государственный художественный музей, Воронежский областной художественный музей, Саратовский государственный художественный музей, Серпуховский историко-художественный музей, Киевский музей русского искусства и т. д.