В 1885 вместе с Е. Г. Мамонтовой организовала в Абрамцево столярно-резчицкую мастерскую, которую возглавляла до 1892. Создала более ста эскизов предметов утвари и мебели, по которым резчиками мастерской выполнялись изделия. Стала одним из основателей в Абрамцево музея народного искусства и гончарной мастерской. В 1884 совершила путешествие по Волге, Дону, Кавказу, Крыму. В 1884–1890 участвовала в поленовских рисовальных вечерах и акварельных утрах. С конца 1888 рисовальные четверги по ее инициативе заменились керамическими.

В конце 1880-х — начале 1890-х создала два обширных цикла иллюстраций, объединивших более двадцати фольклорных произведений, в частности «Белая уточка» (1886), «Лисичка-сестричка и волк», «Волк и лисица», «Иванушка-дурачок» (все — 1887), Дед Мороз» (1888), «Война грибов», «Избушка на курьих ножках» (обе — 1889). В 1887 удостоилась второй премии на выставке Общества поощрения художеств за картину «Иконописная мастерская XVII столетия».

В 1893 стала одним из членов-учредителей Московского товарищества художников. В 1893–1894 участвовала в оформлении интерьера церкви женского ремесленного училища в Кологриве Костромской губернии. В 1895 вместе с А. Я. Головиным, Е. А. и А. А. Карзинкиными путешествовала по Европе. В 1896 сотрудничала в кустарной мастерской М. Ф. Якунчиковой в селе Соломенка Тамбовской губернии, где создавала эскизы вышивок и панно. В 1897 для лечения совершила поездку в Испанию и Францию.

В 1898 разрабатывала проект столовой в русском стиле для дома Якунчиковых в Наре под Москвой, а также занималась подготовкой Кустарного отдела на Всемирной промышленной выставке в Париже 1900. Однако из-за ранней смерти художницы эти работы завершал Головин.

Мемориальные выставки Поленовой состоялись в Москве и Петербурге в 1902. Ретроспективные выставки художницы были организованы в 1925 в Абрамцево, в 1998 в Поленово, в 2000–2001 в Тарусе и Серпухове.

Творчество Поленовой оказало существенное влияние на возникновение неорусского направления в искусстве рубежа XIX — XX столетий. В своих произведениях она стремилась к соединению черт народного и профессионального академического искусства, много занималась художественно-археологическими изысканиями, изучением традиционных орнаментов, фольклора. Наиболее значителен вклад Поленовой в развитие декоративно-прикладного искусства: керамики, деревянной мебели, вышивки. Как станковист она работала меньше, предпочитая живописи акварель. Причем, многие акварельные этюды Поленовой представляют собой разработку орнаментальных мотивов, впоследствии находивших отражение в эскизах мебели и вышивок.

Существует проблема атрибуции произведений художницы в области декоративно-прикладного искусства. Ей, подчас без серьезных оснований, приписывают многие изделия столярной мастерской Абрамцево в «русском стиле», которую она долгое время возглавляла.

Произведения художницы находятся во многих музейных и частных собраниях России, в том числе в Государственной Третьяковской галерее, Государственном Русском музее, ГМИИ им. А. С. Пушкина, Музее-усадьбе «Абрамцево» и многих других.